Das uns heute bekannte Kloster St. Johannis befindet sich erst seit 1914 an seinem jetzigen Standort am Alsterufer in Eppendorf - gebaut nach Plänen der Architekten Kahl & Endresen. Hervorgegangen ist das jetzige Damenstift aus dem Harvestehuder Zisterzienserinnen-Kloster von 1236, das 1343 das kleine "Eppendorf" aufkaufte und verwaltete.
1531 zogen die Nonnen in das Johannis-Kloster um, das damals zusammen mit einer Kirche auf dem Gelände des jetzigen Hamburger Rathausmarktes stand. Dort nannten sie sich Konventualinnen aus dem evangelischen Jungfrauenstift des Kloster St. Johannis.
Ob wegen Baufälligkeit oder infolge des "Großen Hamburger Brandes" 1842, Kloster und Kirche wurden in dieser Zeit aufgegeben. Ein neues Gebäude am Klosterwall (Nähe Johannisstraße) in der Innenstadt wurde erworben. Ebenfalls als Stift geführt, diente es nunmehr sowohl für Nonnen als auch wohlhabenden Witwen aus dem gehobenen bürgerlichen Spektrum als Wohnung. Hausherrin war die "Domina".
Das Ansehen der Damen wuchs im Laufe der Zeit, finanzierten sie aufgrund ihrer Ländereien und ihrer finanziell hervorragenden Ausstattung so manches städtische Projekt, dass die Stadtväter Hamburgs sich aus den Einnahmen der Stadt nicht hätten leisten können. Entsprechend locker waren die Umgangsformen der Stiftsbewohnerinnen gegenüber den Ratsherren, denen das natürlich oftmals ein Dorn im Auge war. Gleichwohl ist bis heute der Brauch geblieben, dass Erste/r wie Zweite/r Bürgermeister*in Patrone des Stifts sind.